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徕卡倒置荧光显微镜电镜标本制备方法

发布时间:2013-12-04   点击次数:2772次

徕卡倒置荧光显微镜电镜标本制备方法

下面就这三方面要求分别加以介绍:

徕卡倒置荧光显微镜的扫描电镜观察的表面一般是组织或器官的自然表面,如呼吸逻,消化道,泌尿及生殖管道的上皮表面。机体中分散细胞的自然表面以及骨胳等硬组织的自然面等。取材时,对于待观察的部分要保护好,切勿用器械触碰。如果上面粘有分泌物,粘浓或粪块等污物,必须在固定前去除,以免遮盖表面微纫结构,清除的方法一般是用温生理盐水或缓冲液冲洗或喷射冲洗,硬组织可用超声波(低频)清洗。有的实验室用蛋白酶类清洗表面的粘液,但必须注意,蛋白酶不仅可除去表面粘附物,也可破坏样品表面的蛋白质。对于分散细胞表面的处理参见另一节。需特别提出的是,暴露出的表面需要清洗,但保存标本的原则与透射电镜标本完全相同;如动物处死方法,取材速度及要求样品中断血液供应后1—2分钟内进入团定液等。与透射电镜标本*不同的一点是样品体积可大些。由子样品台较大,景深较深,扫描电镜样品块可在10mm见方,5mm高的范围。

为确定徕卡显微镜分辨率,可使用半半径(halfmdius缩写HR)或半距离〔hdfdLshnce缩写HD)这两个参数。HR是这样一个距离,对于一个点状放射源,它所产生的全部显影颗粒中的一半将落在以放射源为圆心,以HR为半径的一个圆内;对于一个线状放射源,它所产生的全部显影颗粒中的一半将落在放射源两侧宽度各为HD的一个带内。HR与M对于电镜放射自显影的定量分析是两个十分重要的基本参数。

电镀标本必须干燥。我们观察用徕卡显微镜样品是观察细胞表面的原貌,富有微细结构的样品表面往往经过脱水及干燥后(特别是空气中干燥后)发生严重变形。原因是液价(特别是水)的表面张力破坏了微纫结构。虽然有些可挥发介质如乙醇或丙围的表面张力较小,但对类如气管上皮表面纤毛这样的细微结构仍有损伤。因此,自扫描电镜问世后,虽然不少学者拟用于观察生物样品,就是因为过不好“干燥”这一关而未曾得到好的生物软组织的徕卡倒置荧光显微镜扫描电镀照片。自从1969年开始使用临界点用于操作后,将扫描电镜的生物样品制备大大推进了一步。目前世界上电镜实验室多应用临界点干燥法与冷冻干燥法对扫描电镜进行干燥。

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