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奥林巴斯生物显微镜标本制备方法

发布时间:2013-11-19   点击次数:1182次

 奥林巴斯生物显微镜标本制备方法

 
奥林巴斯生物显微镜分散细胞是指非实体组织的细胞,它们单个分散的存在,如血细胞,胸、腹水中的细胞等。培养细胞虽不是分散细胞,但标本制各原则与分散细胞相似。奥林巴斯生物显微镜分散细胞悬浮于体液中,要使它们聚集,必须经过离心,但离心力会损伤细胞,特别是破坏细胞的表面结构。如血小板在血中为盘状,表面光滑,高速离心后,血小板变囚,表面出现许多突起,成为棘球状。血小板内部也有明显改变,即血小板外形不规则,细胞器及颗粒聚集在血小板中心,被一束微管紧紧围住,傲管与质膜之间有较宽裕的脑浆。这是血小板被澈话的形态学表现。离心可使静止血小板激活。时间过长,速度过高的离心还会使血小板质膜破裂,细胞器溢出。因此,在制备分散细胞标本时,在离心前固定。此外,由于分散细胞悬浮于体液中,将细胞固定后的蛋白质一同固定,而且这些固定后的蛋白小凝块附着在细胞表面,遮盖细胞表面细微结构,妨碍观察。因此必须冲洗充分。此外,必须使分散细胞附着在一个表面上进行脱水、干燥等操作。这几个问题是制理分散细胞扫描电镜标本的特殊问题。下面对奥林巴斯生物显微镜分散纫胞扫描电镜标本制备方法详细分步叙述:
 
1.奥林巴斯生物显微镜固定:只用戊二醛固定便能收到很好的效果,但要两次固定,在*次固定前需使细胞在类似体液的条件下,保持体内的形状。由于血细胞、旗水细胞等在取出时经过穿刺针的纫孔而变形,必须设法使细胞于固定前恢复为原来形状,才能在电镜下看到真实的细胞形态。现以红细胞及血小板为例,详细说明如下:
 
(1)奥林巴斯生物显微镜红细胞:
 
将1滴血(一般取静脉血为好,手指或耳垂取血时由于挤压往往使细胞严重变形而损伤细胞)放到(5—6)m1磷酸盐缓冲液中。缓冲液pH为7.2—7.4,370C,渗透压为Ho毫渗(即与正常人血浆渗透压相等)。
 
(2)奥林巴斯生物显微镜血小板:取静脉血10m1,放入塑料或硅化的玻璃试管中。用构撤酸钠或肝家抗凝,离心[(900一1100)转/分,10分钟],用塑料吸管或硅化的玻璃吸管将富血小扳血浆(PRP)吸出并转移至另一塑料试管或硅化的玻璃试管中,PRP约3—4创,376c温育15分钟,目的是使血小板恢复为正常的形态。加入戊二醛(硝酿盐或二甲肺酸钠缓冲液,PH7.2—7.4),使浓度为o.25%。在37。c下继续温育15分钟,以完成*次固定。胸、腹水细胞以及其它体液中的细胞标本制备方法与以上列举的两例类似,培养细胞的标本制备原则也应该是先预固定后再离心集中。具体做法是在培养液加入戊二醛,同样,浓度为o.25%,15分钟后,用橡皮铲将细胞取出,离心。低浓度戊二醛使细胞初步固定,再经离心集中便不会使细胞严重损伤,但离心力仍不能过大,时间也不能过长。如红纫胞为(900一1100)转/分,8分钟;血小板为xoo转/分,lo分钟。离心后弃上清,在细胞沉淀中加入2%戊二醛,用吸管反复欢打,使细胞分散。于室温下再固定30分钟。如果对同一种细胞在观察其表面结构的同时还要观察内部结构,即需分出一半制做超薄切片标本.则*次固定所用的戊二醛浓度可稍大些,可用o.5%G将细胞离心集中后,取出一半直接用心四氧化饿固定即可。
 
2.奥林巴斯生物显微镜清洗:清洗的目的是除洗去固定液外,还要将细胞分散,即将细胞分成一个个散在的细胞。还要把经戊二醛固定后体液中的小蛋白质凝块洗去,并使这些蛋白质凝块脱离细胞表面,以免遮盖细胞表面超微结构。因此,清洗这一步骤十分重要,需注意以下几点:
 
(1)清洗所用的水必须十分清洁,预先经微孔滤膜过滤以除去水中的细菌及颗粒杂质。
 
(2)清洗时需用力吹打,多次昧打,每次清洗用液量在8mI以上。需清洗三次。
 
(3)清洗用液是双药水,而不用缓冲液。因缓冲液中的盐可能在脱水时析出并粘在细胞表面,使标本污染。
 
(4)每次吹打后需将已用过的滴管洗净,用过滤的双蒸水冲净后第二温清洗时再用*不然会有些细胞钻附滴管壁上,放置室温下便自然干燥。这些自然干燥后的细胞若进到标本中则影响标本质量。
 
(5)每次清洗后需离心,离心时间不能过长,离心力不可太大。因为离心的目的是使细胞沉降,而小蛋白凝块仍悬浮于上清液中,与清洗液一同弃去。
 
3.奥林巴斯生物显微镜脱水与样品附着:由于多次离心使细胞丢失,因此先将细胞附着在玻片或塑料片表面,使细胞随同该进片或塑料片一起脱水、干燥。为使细胞能附着在玻片或塑料片,需先在玻片或塑料片上铺设一层膜。铺膜方法如下:
 
(1)zui简单的方法是铺一层薄的聚乙烯醇缩甲醛(for帅)膜。将洗净的玻片在(o.5—1)%聚乙烯醇绍甲醛氯仿溶液中浸蘸,待氯仿挥发后玻片上呈现一层白膜,将玻片在氯仿中振荡几次使膜变薄即可用。
 
(2)将o.1%多聚L一赖氨酸(制备时将1mg多聚赖氨酸溶于lml过滤后的水中)墒在洗净的玻片上,待液滴展开后在45。c烘箱中干燥。此种方法,因为多聚l—赖氨酸带正电荷,能使较多的表面带负电荷的细胞附着。
 
(3)将血浆和甘油各以(30一40)%,和(3—5)%的比例加到蒸馏水中,成为甘油蛋白浓。将该液滴在洗净的玻片上,展开并烘干。将铺好的蛋白膜浸入2%戊二醛中使蛋白固定,洗净后干燥可备用。使用前将血浆滴在该蛋白膜上使之“活化”.30分钟后用缓冲液冲淡,便可直接应用。
 
奥林巴斯生物显微镜将固定与清洗后的细胞用过滤后的水制成浓度适宜的细胞悬浓,悬滴在已铺好膜的玻片或塑料片上,在湿润、低温(40c)环境中放置(30一120)分钟,使细胞附着到膜上。用细镊子夹起玻片在清洁的双蒸水中振荡,洗去末附着的细胞。然后迅速故人盛有50%丙损(或乙醇)的器皿中。脱水过程是将玻片每隔约3分钟,依次故入浓度递增的丙酮或乙醇中,或在放玻片的器皿中不断增加脱水剂浓度。据作者所在实验室经验,后一种操作比较方便。具体做法可每隔3分钟将器皿中的脱水剂吸出一半,再加入浓度为loo%的等量脱水剂。经过5—6次操作,器皿令脱水剂浓度达99.5%以上。细胞脱水成功。临界点干燥后将玻片或塑料片用导电胶粘于样品墩上进行金屈镀膜。
 
奥林巴斯生物显微镜利用第三种方法铺设的膜附着细胞也有方便之处。可将经低浓度戊二醛固定后的细胞悬满在“活化”后的蛋白膜上,放置10分钟,将玻片或塑料片浸于2%戊二醛中,30分钟后用过滤双蒸水冲清,再按上述方法脱水、干燥及金属镀膜。
 
备注:奥林巴斯生物显微镜标本制备方法,部分文章由北京中仪光科科技发展有限公司编辑上传。
 
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