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徕卡倒置荧光显微镜要求

发布时间:2013-10-21   点击次数:1017次

徕卡倒置荧光显微镜

徕卡倒置荧光显微镜由于高分辨扫描电镜的间世,为用表面标记技术观察细胞表面形态和区别两类纫胞群与其表面形态相的机能提供了条件。用此技术方法可研究细胞表面抗原、受体的性质,分布及运动。在原则上,透射电镑与荧光显微镜用的免疫标记技术也适用于免疫扫描电子显微术。但由于徕卡倒置荧光显微镜扫描电镜与透射电镜的成像原理不同,因此对免疫扫描电境术的标记物有些特殊要求。这些要求是:

1.清晰、容易识别的形状‘对透射电镜的标记物要求电子致密度高,扫描电镜的标记物电子密度不是重要问题,而形状是识别的重要因素。

2.大小适宜:一般而言扫描电镜分辨率低于透射电镜,此外扫描电镜标本要金屑镀膜,这都影响样品表面结构的分辨。因此标记物若太小、结构过于微细,就不能与样品表面固有结构区别,但标记物过于大,又不能明确定出去面抗原位置,因此标记物大小要兼顾以上两方面。

3.化学性质稳定,在标本处理过程中不会被损坏品制备过程中能牢固地结合。

4.对细胞表面的固有亲合力差。

符合以上条件的较常用的表面标记切有人工合成的非生物材料(胶乳颗粒,硅酸聚合物等),生物大分子(铁蛋白,血蓝蛋白等),病毒(1MV),噬茵体和肢体金颗粒等。

徕卡倒置荧光显微镜胶乳颗粒有聚苯乙烯和丙烯两种*聚苯乙烯类颗粒表面疏水,易发生自聚集。但与抗体以适当比例混合时,不需偶联便能很好地与抗体附着。丙烯类颗粒表面有oH基,自发聚集少。标记时可利用oH基进行偶联。

如果样品以苯乙烯树脂做为包埋剂,徕卡倒置荧光显微镜再行割断法做扫描电镜观察是十分方便的。因为苯乙烯聚合后,氧化丙烯及醋酸异戊酌等很容易将其溶解,多次更换溶剂便可将苯乙烯清除干净。因此,在制做透射电镜标本时,多做出几个包埋胶囊样品,待聚合后,按上述方法割断,将割断好的样品放在氧化丙烯中,约2小时后便可经酷酸异戊酷置换、临界点干燥。

除树脂割断法外,徕卡倒置荧光显微镜尚有有机溶剂(酒糟、酷酸异戊圈等)割断法;水溶性包埋剂(二甲基亚矾、甘油等)割断法及其它(冷冻、氟里昂等)割断法,操作都很容易。再以酒精割断法为例:样品固定后用酒精脱水,当脱水完成后,将样品投入预先装有无水乙醇的胶囊中(避免出现气泡)。将胶囊放在低温装置内使乙醇固化。进行样品割断。割断的样品立即进入置于室温的无水乙醇中,待乙醇融化后移入醋酸异戊酷、进行临界点干保。

徕卡倒置荧光显微镜硅酸聚合物颗粒为球形。使用时先加入Y一氨基三乙氧基丙硅烷(Y咆加n04r出hoxypr叩山1ane)使颗赣表面带一NH3,然后再与抗体偶联。

TMv长300nmp宽16nm助长杆状结构。扫描电镜下识别性好。能与18G牢固地结合,形成TMv一[8G复合物。如果红细胞表面附有正常免[8G,TMv便能使这种红细脑布满杆状物*由于该病毒过长使分辨率下降,也有实验室将其截短使用。

常用的噬茵体是T4噬苗体(以大肠杆菌为宿主)有头有尾,形如瞅助。在徕卡倒置荧光显微镜扫描电镜下识别性能好。但体积较大,由x174也是以大肠杆菌为宿主的噬茵体,呈二十面体。因为体积较小,需用高倍观察。

如果徕卡倒置荧光显微镜应用高分辨率扫描电镜.金标记是理想的。铁蛋白虽然有高电子密度,但分子毕竟大小,因而应用有限。

徕卡倒置荧光显微镜关于抗体的纯化与透射电镜所用的有关方法相同,抗体与标记物的偶联也不在此赘述。

备注:徕卡倒置荧光显微镜,部分文章由北京中仪光科科技发展有限公司,编辑整理上传。

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