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金相显微镜--显微分光光度计

发布时间:2012-01-14   点击次数:2338次

金相显微镜--显微分光光度计

显微分光光度计是—‘种在不同波长下测定显微镜标本成分光吸收的仪器、实质上它是长期用于分析化学中的分光光度计与显微镜的结合。它可以用来测定细胞或细胞器内一些重要的大分子物质(如DNA、RNA、蛋白质等)的含量,因此在绷qb化学和组织化学的定量研究中是一种必不可少的工具。

金相显微镜--显微分光光度计主要由光源、干涉滤片(或单色仪)、专用显微饶、测量装置和显示控制系统等儿部分所组成<图16.4)。这种仪器具有双重光源系统,一个观察光源使用低压白炽灯,用于观察和聚焦显微镜标本;另一个是光度计光源,使用高压气体放电灯.用于标本的光度测量。光源连接有高度精密的稳压供电系统,一般输出电压的变化控制在o.033%以内。用于分光光度术的显微镜是高性能的专门研究显微镜,它可以组装双重光源和测旦装置,并且在光度计筒内具有一个特殊的测量光阑,光阑的直径可以改变,直到可以测量直径为1μm大小的测量区域,测量光阑可以根据被测物体的形状选用圆形、八角形、方形或矩形的。

金相显微镜--显微分光光度计由于生物标本中被测定的不问物质在光谱吸收曲线上有特异的吸收高峰,因此在测定某一物质时,必须使用能够产生很窄光谱区域光的于涉滤片。这种干涉蹈片分为两种,一种是窄通带干涉滤片,带宽为o.5一15nm,另一种是宛通带干涉滤片,带宽为15—18nm。能够产嫂单色光的比较理想的另一种装置是单色仪(图16.;中的3),它诬道光栅(或棱镜)散射来自具有连续发射光谱的强光源的光,然后在一定的光谱范围(200一1,ooonm)内可以任意选择具有很窄带宽的单色光,在单色仅中波长范围的调节完全是自动的,因此通过标本光的波长可以迅速灵活地改变,使用非常方便。在使用单色仪时,通过调节,使单色仪出缝的像成在孔径光闹的平面上,并且让孔径光阑正好充满单色仪的出缝。出缝的宽度可以选择,但从图16.6冲单色仪波长选择刻度盘上可以看出,出缝放宽,单色光的带宽愈大。当出缝宽度为o.5mm时,带览为3.3nm,当比缝为3mm时,带竟则为19。8nm。

图16.6可以说明显微分光光度计的使用原理,两条光谱吸收曲线I和Ⅱ是在显微分光光度计上,用通过火蛇红血细胞的细胞质和细胞核的直径为lvm的光点进行测量而记录的。在这种纫胞的细胞质中血红蛋白的出现引起丁近545nm处的*个吸收高峰,而更高的第二个局峰出现在416nm处;在紫外光区域出现吸收的*次下降,在300一320nm处又回升出现3个高波。在细胞核的吸收曲线(Ⅱ)中,在416nm处也观察到•—个吸收高炼,但这并不是细胞核本身的吸收,而是由于分市在光束所要通过的细胞核.上面和下面的细胞质中大量的血红蛋白所引起的;在较短波长曲紫外光范围内,在260nm范围可以观察到非常明显的zui大吸收值,这个范围的吸收除了蛋白质的吸收以外,zui主要的足由细胞核中高浓度的核酸在260nm处的特异吸收所引起的。

金相显微镜--由于在显微分光光度计中,通过标本的光束在大多数情况下直径只有一至几个Mm,因此要记录这样一个小光点的非常微弱的信号就需要非常强的放大装置,现在一般使用光电倍增管。光电倍增管可以把微弱的光信号变为电流,并且能够放大10‘一10’倍,因此它的灵敏度是非常高的。测量的结果可以通过显示系统以数字显示出来,或者通过电传打字记录下来。

作为分光光度计的基本原理也适用于显微分光光度计,当光线迎过物质标本的单色溶液时,除了少量的反射和散射而外,一部分光被吸收过。透射光密度(11)与入射光密度(1o)的比值被称为透射串(T),—种具有光吸收而剩余的光透在一定的条件下,例如当溶液为单色并且不存在浓度放应时,透射率倒数的以10为底的对数与生色物质的浓度成比例关系,这个数值被称为消光值(E)。

金相显微镜--在显微分光光度计上所进行的生物标本中光吸收物质的测定就远还没有如此简单,即就是当染料(或天然色素)具有己知的吸收光谱并且服从于郎伯一比尔定律时也是非常复杂的。在这种生物标本中不仅光学密度是完全异质的,而义它的形状是不规则的,光程长也是不清楚的。只有当被测物体的形状是规则的几何形状时才接近于比色槽的情况,这种情况出现在具有球体形状的细胞核中。在理论上,一个用字尔根法染色的细胞核可以看作是未染色的细胞质中在球形比色槽内的碱性品红染料的溶胚。

对于生物学标本的显微分光光度测量会受到一种分初误差的影响,这种误差是由于生物物质的不均匀分布所造成的,在有些情况下这种误差可能是相当大的。因此在显微分光光度术中,一般可以来用扫描法、双波法、——波双区法等几种方法克服生色物质分布的不均匀性效果,从而可以在一定程度上解决分稍误差的问题。在使用自动扫描仪器时,物体可以被分割为很小的区域,因此可以把每个小区域当作是均质的,这样采用综合一系列的消光值读数,对于整个生色物质来说就可以得到一个总的消光值。

金相显微镜--显微分光光度计使用一种新型的像扫描或标本扫描仪器和积分显微光度计,并且尽量避免不同来源的误差时,就可以以一定的重复性直接测定游离的红血细胞中30pg(30×10-12克)的血红蛋白的员;并且可以通过特殊的罕尔根染色反应以同样的准确度和精密度测定细胞核中的DNA,也可以通过对于蛋白质干扰的矫正在天然吸收的基础上对核酸进行测定。

 

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