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徕卡体视显微镜

发布时间:2013-05-22   点击次数:2970次

 徕卡体视显微镜对组织切面的观察日断法

以前所介绍的徕卡体视显微镜各种方法都是观察生物组织自然表面的方法,而这里要介绍的是用徕卡体视显微镜扫描电镜观察细胞内部与实质性器官内部的方法。该方法由日人田中敬一始建,称割断法。其含义是用刀借助切断包埋剂而切开组织细胞,使其内部结构暴露,从而进行观察。以树脂割断法为例,简要介绍如下:
 
树脂割断法是zui早创始的割断法。常用的树脂为Arald比(在一300c固化),也可使用Epon812(一80℃固化)。的方法的要点是用树脂包埋后,不要使树脂聚合,而是在低温下使之固化。割断后恢复到常温时用有机溶剂再洗去树脂。样品的取村、固定、脱水过程与透射电镜标本全同。脱水后的样品经氧化丙烯置换后放入胶囊中。样品放入前胶囊内预先装好村脂。与透射电镜样品制备不同的是只需树脂本身,而不加增塑剂与聚合剂等。树脂对样品的浸透也不必完全充分,浸透不充分的样品有时会给出有趣的断面。一般说来经过一夜的浸透后便可将胶囊放至低温冰箱、干冰或液氮中固化,然后将样品“割断”。割断的步骤是先在冷冻的胶囊表面横划一沟痕将单面剃须刀片或多叶木工刀的刀刃垂直放在沟疽内,用一木梯以适当的力量敲击刀背,胶囊被敲断时其中的样品随之震裂。样品的断裂面如玻璃被割开那样光洁。将断裂的胶囊投入氧化丙烯中,使树脂镕去,样品离开放囊。更换数次氧化丙烯使树脂完全滑除,然后树样品移入醋酸异戊6中进行临界点干燥。
 
如果样品以苯乙烯树脂做为包埋剂,再行割断法做扫描电镜观察是十分方便的。因为苯乙烯聚合后,氧化丙烯及醋酸异戊酌等很容易将其溶解,多次更换溶剂便可将苯乙烯清除干净。因此,在制做透射电镜标本时,多做出几个包埋胶囊样品,待聚合后,按上述方法割断,将割断好的样品放在氧化丙烯中,约2小时后便可经酷酸异戊酷置换、临界点干燥。
 
除树脂割断法外,尚有有机溶剂(酒糟、酷酸异戊圈等)割断法;水溶性包埋剂(二甲基亚矾、甘油等)割断法及其它(冷冻、氟里昂等)割断法,操作都很容易。再以酒精割断法为例:样品固定后用酒精脱水,当脱水完成后,将样品投入预先装有无水乙醇的胶囊中(避免出现气泡)。将胶囊放在低温装置内使乙醇固化。进行样品割断。割断的样品立即进入置于室温的无水乙醇中,待乙醇融化后移入醋酸异戊酷、进行临界点干保。
 
需指出的是经割断法制备的标本需要用高分辨率的扫描电镜(如场发射电子枪扫描电镜)进行观察。一般的扫描电镜分辨率低于透射电镜,若用扫描电镜割断法观察组织、细胞的内部结构,以和透射电镜团相对比,必须用场发射电子枪扫描电镜。由于扫描电镜立体感较强,割断样品在镜下显现出高尔基扁平囊与大泡、小泡的空间分布;线粒体峭像隔板一样伸展;核糖体像小蘑菇一样附着在内质网“板”上。尽管如此,有些学者认为割断法并未提供细脑结构的新信息。因此该方法应用不广泛。
 
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