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生物显微镜的成像原理(一)

发布时间:2011-11-25   点击次数:18068次
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显微镜(mimcroscPe)简称光镜,是一种将肉眼无法看清楚的微生物体进行光学放大成像的常用仪器c在生命科学、材料科学、基础科学及众多的微观领域中都离不开显微镜。
 
1590年,荷兰的Hans父子始创放大10倍显微镜.
1758年,Dounnd制成消色差透镜,提高了显微镜放大倍数。
1873年,德国科学家Abbe设计成近代显微镜。
1953年.上海江南光学仪器厂国产显微镜诞生,并陆续生产了荧光、相衬、偏光等专用显微镜。
 
生物及医用显微镜可分为光学放大及电子放大两大类。前者按用途可分为普通型、特种型、型显微镜和手术显微镜。普通型生物显微镜仅供一般用途使用,通常的农用与医用显微镜、倒置显微镜均属这一类。特种型生物显微镜可作某些专用的观察和研究。暗场生物显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、相衬和干涉相衬显微镜等均属于这一类。型生物显微镜系指大型多用途的生物显微镜,研究用生物显微镜和研究用生物显微镜等属于这一类。
 
显檄镜放大成像系统
 
显微镜光学系统由物镜和目镜两部分组成。因为被观测的物体本身不发光,而借助于外界照明,故显微镜需要有一个照明系统,这些部分都是由较复杂的透镜组成,尤其物镜更为复杂。
 
图3—1是显微镜成僚的光路原理团,图中的物镜和目镜均用薄透镜表示。
生物显微镜
显微镜的物体AB处于物镜的2倍焦距之内一倍焦距之外,它首先通过物镜成一大的倒立实像4’B’,且使之位于目镜的物方焦平面上或焦平面以内很靠近的地方,然后目镜将这一实像再次成一个正立虚假A”B”扩于无限远或人眼明视距离之外,以供眼睛观察。显微镜对物体进行2次放大,因此与放大镜相比,具有更高的放大倍率,能观察到肉眼所不能直接观察的微小物体,分辨更细小的细节。在这里目镜相当于放大镜.只不过这时放大镜的物是物镜所成的像而已。由于物镜所成的像是实保,因而可在实像处(即目镜的物方焦平面处)安放各种用途分划板,供对准或测量用。
 
二、显微镜的放大率与分辨本领
 
1.显微镜的分辨本领
 
分辨本领主要指接物镜分辨被检查物体细微结构的能力,也就是说在显微镜下别的zui小微粒的大小或两点之间zui短距离及某物点zui小直径的限度,便叫做显微镜的分辨本领,或称为鉴别率。通常用d表示:
从式中可知,显微镜的分辨率主要取决于光的波长和数值孔径这两个因素。d值越小,分辨本领也就越强,越能看清物体的细微结构。鉴别率计算单位是Mm。
 
生物显微镜的鉴别率的提高只有两个办法:
 
(1)增大物镜的数值孔径(镜口率)。从图3—2可以看出,影响数做孔径(nsina)的因素有两个:其一为物体上某点射人物镜光锥角(镜口角)的一半(sina);其二为检品与物镜间媒质的折射率n。即数值孔径为NA=nsina。镜口角半数zui大能到90°,故sina的zui大值为1.00,这时物镜的焦距zui短而曲度也很大,制造上是极为困难的。即使能办到,在干燥系中的镜口率只有l×sin90°=1.00空气n=1)o若再增大镜口率便只有从媒质着手,所以便有水、甘油,石蜡油和香柏油等浸润均匀媒质的应用,确实改进了镜口率不少,它zui高可到1.40。如果用溴荣液可达1.67左右,更接近盖片和透镜的折射率。
 
(2)缩短光源的波长:采用紫外线作光源,波长可到0.1υm,这样放大倍数比自然光放大的倍数大3—4倍,普通紫外线光波在0.2υm左右,即使能产生出0.1υm波长的紫外线,一般透镜也将把它吸收干净,无法利用。 

显微镜的zui大数值孔径可达1.5υm左右,在这种情形下:

即在这种显微镜里,仍可分辨的两点间zui短距离差不多等于所用光波波长的1/3。假定绿光的光波的波长λ=5.46xl0ˉ5cm,那么显微镜能分辨的zui短距离为:

则这台显微镜的zui高分辨距离也超不过0.182υm。向眼在明视距离(250M)能分辨的两点之间zui短距离为0.1mm,约为上述d值的560倍,因此1台光学显微镜的放大率有1000倍也就足够了。这是因为光的本性及光的绕射现象就限制了显微镜的放大极限。凡是光波超过微粒直径的2倍时,光线就很方便地绕过微粒而继续前进,所以普通干燥系显微镜的zui大鉴别率只能达到光源波长的1/2,直径小到0.2υm的微粒就无法被光学显微镜发觉。虽然后来应用浸润系方法,如油镜,提高了折射率,其鉴别率也只不过能提高到光源波长的1/3而已。而且还要用的透镜才能达到。

2.显微镜的放大率

对于有一定大小的细节,除应该用适当的数值孔径的物镜而外,整个显微镜也应该有适当的放大倍数与之相适应,才能看清细节,这种放大倍率称之为有效放大率。这是实际下作应该考虑的问题,每个物镜都有它的有效放大率。

在使用生物显微镜过程中,每个物镜都配多大的倍数的目镜,应该特别注意。一般而言,显微镜的zui高放大倍数不得超过所使用物镜镜口率(NA)的1000倍,否则即产生畸变而失真。例如,其物镜的放大倍数为lO×,为0.25,则0.25x1000=250,即与这个物镜配合使用的接目镜其放大倍数不应超过25倍,因为25×10=250。与油浸系配合的目镜放大倍数应更小些,例如,有一个l00x,N•A为1.4,则1.4x1000=1400,即接目镜的放大倍数不应超过14×,因为14×100=1400。通常总是低倍物镜配合高倍目镜,高倍物镜配合低倍目镜,便是这个道理。

目前生物显微镜一般油浸物镜NA=1.25或1.3左右,所以,一般放大1250或1350倍已经够了,而zui大川为1.5,所以国家规定显微镜的zui高倍数为1250倍,而通常显微镜zui高倍咖良少超过1500倍。如果1台显微镜zui高放大2500倍,实际上放大1000倍时有鉴别率。放大倍数太大,也是无效的.因为放大到一定限度后,把像再放大也不会使我们看到更小些的细节,如果勉强放大,只会使像变得模糊反而影响清晰。也有超过1500倍的,其实也就是目镜倍数大了一些,这是为了照相或投影之用。

生物显微镜各物镜有效放大率情况见表3—2。

4.几个有关的概念

(1)显微镜的机械管长。是指从任何——个接物镜的接合螺丝抵肩换器吻合处起,到接口镜筒上缘止的这一段距离而言为机械管长。

如有抽筒则指还未被拉起的长度.抽筒可从150mm拉到250mm。在干燥系中是使用显微镜冈有的镜筒长度或抑筒未被拉起的长度c油浸系则须拉抽简拉到170M,当观察不透明的物体时,便应拉到190mm或250mm,这也是机械管长。现在一般无抽筒显微镜或有抽筒而未被拉起时.多固定为160mm。

(2)生物显微镜的光学管长。是指从接物镜的上焦面起,到接目镜下主焦面止,这段距离而言为光学管长。

它的简单测定方法:从接物镜上组透镜的亡面量到接目镜的光栏环隔为止,约得1个近似数值。在干燥系情况下,多为140mm,也可小至128mm以下,油浸系则可高到180mm以上。光学管长关系着次级放大倍数,非常重要。

(3)显微镜的操作距离。是指接物镜下端与盖片之间的距离而言,为操作距离。

一般鉴别率小者则操作距离大,反之则小。因为操作距离大,镜口角一定小,于是镜口率也小,即吸收光量的能力弱,所以鉴别率就受到限制。反之操作距离小,则接物镜与盖片越接近,则镜口角就大,而吸收光量也相应增大,鉴别率自然会增强。

一般显微镜的操作距离为16—0.65mm,但也有长至55mm而短至O.5mm的。

(4)明视距离。出于眼睛的调节作用,所看清楚的zui远和zui近的两点,分别叫远点和近点,正常眼远点无限远处,近点在10—15cm。当物体距离眼睛25cm时,在人眼的视网膜上造的像zui为清晰。而且看起来不易感到疲劳,这个距离叫明视距离。显微镜的明视距离规定为25cm,就是这个道理。

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