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半薄冰冻切片光学显微镜的使用

发布时间:2011-10-07   点击次数:2792次
半薄冰冻切片光学显微镜的使用 。

半薄的部分,可从cryoprotected生物材料的冷冻块切片在-90 ° C。 
光学显微镜的使用这些路段的优点是subcellullar形态保存和改进的光学分辨率 。  化学固定的生物材料是cryoprotected浸泡在2.3米,蔗糖和浸泡在液氮中冷冻到标本引脚 。  切片是执行与调整,切较厚部分(0.3至1μm)的ultramicrotome的厚度控制在低温- ultramicrotome。  一旦已取得的部分,他们是从使用蔗糖液滴的刀,但它们置于玻片上,而不是放在标本电网。 

 玻片上应注明对其中的部分将被放置标记的玻璃,洗,然后外套的玻璃面的钻石铅笔 。  用洗涤剂和水清洗后,他们可能会涂要么明胶,聚- L -赖氨酸或阿尔辛蓝 。  对于这些*,下降1%明胶被涂污在玻璃上使用的是第二张幻灯片和风干的幻灯片 。  对于其他两种方法,见下文。  涂层的幻灯片,可确保部分粘在标签过程的幻灯片。
 免疫标记的玻片上的冰冻切片 。

浸入幻灯片,与部分,成Coplin含有PBS JAR。  这将洗去蔗糖。
浸入到用含50毫米氯化铵在为了解渴自由醛基的幻灯片 。
浸入到PBS的幻灯片,包含阻断剂(如1%明胶 )。  删除的幻灯片,幻灯片等的部分和他们周围的区域保持湿干表面。  重要的是,部分没有干出来的。
把加入10μl-20μL稀释,离心抗体的上部分,在潮湿的气氛中离开15分钟到 24小时。
抗体洗净,用新鲜的PBS(一个Coplin JAR) 。
重复抗体孵育和洗涤步骤与二级fluoresceinated抗体(步骤4和5)。
安装在90%甘油的PBS的幻灯片,或冲洗水和含Moviol或Permount防褪色的化合物挂载。  这将产生一个*性的装载荧光信号是不容易漂白,当暴露在紫外线下 。 

 与自体荧光的问题

如果所研究的材料是用戊二醛固定,然后自体荧光将出席 。  这可以由0.1%硼氢化钠的PBS(pH值8)治疗的部分被删除。  硼库存解决方案,可以无限期地储存在pH值12 。  在pH 7分子的半衰期为10秒。  在pH 8的半衰期为100秒。
 如果从组织的自体荧光,然后金或酶标记的抗体可以取代二次荧光抗体 。  在这样的抗体结合可以可视化使用银增强揭示的黄金,或产生酶细胞化学在组织切片的彩色反应产物。
 聚- L -赖氨酸涂层玻片
 在100毫升蒸馏水溶解聚- L -赖氨酸10毫克。
 保留干净,标志着幻灯片,在这30分钟的解决方案。
 无论是空气干燥,不洗或冲洗蒸馏水简要 。 

 阿尔辛蓝玻片上的涂层 。 

 0.5%阿尔辛蓝原液
 这个解决方案1:100用蒸馏水稀释
 在稀溶液中10分钟,浸干净,显着的幻灯片。
 简要蒸馏水冲洗幻灯片。  这洗之后,他们将继续略带蓝色 。
 晾干后方可使用,并且只使用新鲜配制的幻灯片。
 
备注:此文章来源英文版本,如翻译有误需原文的请,北京中仪光科科技发展有限公司http://www.cnnoptics.com/
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